枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠創(chuàng)制及應(yīng)用

目錄
前言
第1章　枯草芽孢桿菌概述　1
1.1　枯草芽孢桿菌系統(tǒng)生物學(xué)研究　1
1.1.1　多組學(xué)分析不同層次調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝流的作用　1
1.1.2　基因表達(dá)調(diào)控中的sRNA和反義RNA　2
1.1.3　翻譯后調(diào)控和變構(gòu)相互作用　3
1.1.4　中心代謝中的酶-酶相互作用　4
1.2　枯草芽孢桿菌代謝調(diào)控元件與基因組改造工具開發(fā)　4
1.2.1　基因表達(dá)調(diào)控元件的開發(fā)　4
1.2.2　無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和芽孢桿菌遺傳工具箱　5
1.2.3　合成RNA工具的開發(fā)　6
1.3　枯草芽孢桿菌代謝工程策略　6
1.3.1　模塊化途徑工程　6
1.3.2　限制代謝溢流、降低細(xì)胞裂解　7
1.3.3　高通量篩選　7
1.3.4　基因組縮減　7
1.3.5　輔因子工程引導(dǎo)的代謝優(yōu)化　8
1.3.6　轉(zhuǎn)運(yùn)工程策略　8
1.4　枯草芽孢桿菌底盤細(xì)胞改造與構(gòu)建　9
1.4.1　枯草芽孢桿菌底盤細(xì)胞的研究進(jìn)展　9
1.4.2　枯草芽孢桿菌底盤細(xì)胞的應(yīng)用　11
參考文獻(xiàn)　13
第2章　枯草芽孢桿菌代謝元件的挖掘與創(chuàng)新　20
2.1　枯草芽孢桿菌CRISPR工具箱　20
2.1.1　CRISPR-Cas系統(tǒng)及其在基因編輯和表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用　20
2.1.2　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢桿菌多基因編輯系統(tǒng)　22
2.1.3　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢桿菌多基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)　30
2.2　基于凝血酶-核酸適配體的代謝調(diào)控元件　36
2.2.1　體外結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換型熒光生物傳感器的構(gòu)建與功能驗(yàn)證　38
2.2.2　基于DNA適配體的動(dòng)態(tài)上調(diào)元件的設(shè)計(jì)、優(yōu)化及應(yīng)用　41
2.2.3　基于RNA適配體的動(dòng)態(tài)下調(diào)元件的設(shè)計(jì)、優(yōu)化及應(yīng)用　46
參考文獻(xiàn)　51
第3章　枯草芽孢桿菌代謝途徑的設(shè)計(jì)與重構(gòu)　57
3.1　基于穩(wěn)態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的代謝途徑瓶頸診斷　57
3.1.1　GlcNAc合成途徑動(dòng)力學(xué)模擬　57
3.1.2　潛在限速步驟存在時(shí)GlcNAc合成起始階段動(dòng)力學(xué)模擬　60
3.1.3　GlcNAc合成起始階段的動(dòng)力學(xué)測(cè)定　61
3.1.4　GlcNAc合成途徑潛在限速步驟的分析及鑒定　62
3.1.5　阻斷GlcNAc-6-P與GlcNAc之間無(wú)效循環(huán)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和GlcNAc合成的影響　63
3.1.6　小結(jié)　65
3.2　基于氧化還原力平衡的代謝途徑設(shè)計(jì)優(yōu)化　66
3.2.1　輔因子工程　66
3.2.2　輔因子工程策略　68
3.3　基于非天然氨基酸的細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝途徑調(diào)控　74
3.3.1　枯草芽孢桿菌中非天然氨基酸系統(tǒng)　75
3.3.2　非天然氨基酸系統(tǒng)用于細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝途徑調(diào)控　76
3.3.3　非天然氨基酸系統(tǒng)用于生物封存　76
3.3.4　小結(jié)　78
3.4　基于功能膜微域的代謝途徑區(qū)室組裝　78
3.4.1　細(xì)菌中的功能膜微域　78
3.4.2　FMM在質(zhì)膜上的分布及動(dòng)力學(xué)行為　79
3.4.3　腳手架蛋白FloA和FloT的相關(guān)性分析　81
3.4.4　FMM-多酶復(fù)合體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建　84
3.4.5　動(dòng)力學(xué)模型和代謝物動(dòng)力學(xué)表征底物通道　87
3.4.6　FloT和SPFH結(jié)構(gòu)域過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響　89
3.4.7　FMM-多酶復(fù)合體與酶表達(dá)的相關(guān)性分析　91
3.4.8　工程菌的理化性質(zhì)改造和活細(xì)胞檢測(cè)　92
3.4.9　FMM改造對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響　95
3.4.10　基于FMM組分修飾的途徑酶組裝　96
參考文獻(xiàn)　98
第4章　枯草芽孢桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)的組裝與適配　102
4.1　基于基因回路的代謝網(wǎng)絡(luò)自動(dòng)全局調(diào)控　102
4.1.1　枯草芽孢桿菌中可編程生物傳感器耦合CRISPRi基因回路　102
4.1.2　基于雙功能丙酮酸響應(yīng)基因回路的B.subtilis中心代謝全局控制　116
4.2　基于細(xì)胞群體感應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)　128
4.2.1　枯草芽孢桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)概述　128
4.2.2　組氨酸激酶KinA改造對(duì)芽孢產(chǎn)生的影響　131
4.2.3　構(gòu)建Spo0A-P調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)水平文庫(kù)　133
4.2.4　受Spo0A-P激活調(diào)控啟動(dòng)子的構(gòu)建　135
4.2.5　受Spo0A-P阻遏調(diào)控啟動(dòng)子的構(gòu)建　136
4.2.6　Phr60-Rap60對(duì)Spo0A-P調(diào)控能力的影響　138
4.3　基于多模型驅(qū)動(dòng)的代謝網(wǎng)絡(luò)智能化調(diào)控　140
4.3.1　GSMM搭建及應(yīng)用　141
4.3.2　基于GSMM驅(qū)動(dòng)的代謝網(wǎng)絡(luò)智能化調(diào)控　144
4.3.3　基于TRNM驅(qū)動(dòng)的代謝網(wǎng)絡(luò)智能化調(diào)控　146
4.3.4　基于多約束模型驅(qū)動(dòng)的代謝網(wǎng)絡(luò)智能化調(diào)控　148
4.3.5　展望　150
4.3.6　小結(jié)　151
參考文獻(xiàn)　152
第5章　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成瓜乙酰氨基葡萄糖　158
5.1　中心碳代謝優(yōu)化促進(jìn)GlcNAc合成　159
5.1.1　阻斷副產(chǎn)物乙偶姻溢流對(duì)GlcNAc合成的影響　161
5.1.2　阻斷乙偶姻合成導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸溢流　162
5.1.3　添加碳酸鈣和恒pH補(bǔ)料分批發(fā)酵對(duì)GlcNAc合成的影響　164
5.1.4　阻斷副產(chǎn)物乙酸溢流對(duì)GlcNAc合成的影響　166
5.2　關(guān)鍵酶強(qiáng)化改變碳代謝流分布促進(jìn)GlcNAc合成　168
5.2.1　N端融合標(biāo)簽提高關(guān)鍵酶CeGNA1表達(dá)　169
5.2.2　RBS優(yōu)化對(duì)GlcNAc合成及關(guān)鍵酶CeGNA1表達(dá)的影響　172
5.2.3　整合表達(dá)關(guān)鍵酶EcGlmS促進(jìn)碳代謝通量流向GlcNAc合成途徑　173
5.2.4　關(guān)鍵酶EcGlmS5，端融合mRNA穩(wěn)定子對(duì)GlcNAc發(fā)酵的影響　174
5.3　途徑酶優(yōu)化促進(jìn)GlcNAc合成　177
5.3.1　丙酮酸積累對(duì)胞外pH和胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的影響　177
5.3.2　關(guān)鍵酶CeGNA1定向進(jìn)化對(duì)GlcNAc合成的影響　178
5.3.3　脲酶表達(dá)對(duì)胞內(nèi)pH及GlcNAc合成的影響　181
5.4　中心氮優(yōu)化促進(jìn)GlcNAc合成　184
5.4.1　阻斷谷氨酸胞內(nèi)降解途徑對(duì)GlcNAc發(fā)酵的影響　185
5.4.2　異源表達(dá)谷氨酸脫氫酶對(duì)GlcNAc合成的影響　186
5.4.3　異源表達(dá)NADH依賴型谷氨酸合成酶對(duì)GlcNAc發(fā)酵的影響　187
5.5　展望　190
參考文獻(xiàn)　191
第6章　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成人乳寡糖　197
6.1　人乳寡糖與人類健康　197
6.2　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成2'-巖藻糖基乳糖　199
6.2.1　2'-巖藻糖基乳糖及其生產(chǎn)簡(jiǎn)介　199
6.2.2　枯草芽孢桿菌中GDP-L-巖藻糖從頭合成途徑的構(gòu)建　203
6.2.3　枯草芽孢桿菌中GDP-L-巖藻糖回補(bǔ)合成途徑的構(gòu)建　203
6.2.4　GDP-L-巖藻糖合成培養(yǎng)基的篩選　204
6.2.5　2'-巖藻糖基乳糖的合成與外源巖藻糖基化酶的篩選　205
6.2.6　胞內(nèi)底物運(yùn)輸及輔因子合成的強(qiáng)化　207
6.2.7　內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白強(qiáng)化、膜合成蛋白調(diào)控和途徑酶融合　212
6.3　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成乳酰新四糖　218
6.3.1　乳酰-W-新四糖概述　218
6.3.2　枯草芽孢桿菌中LNnT異源合成途徑的構(gòu)建　221
6.3.3　模塊化途徑工程優(yōu)化LNnT合成代謝網(wǎng)絡(luò)　228
6.3.4　CRISPRi動(dòng)態(tài)調(diào)控策略提高LNnT的合成　234
6.3.5　基于啟動(dòng)子工程的無(wú)質(zhì)粒和芽孢LNnT合成菌株的構(gòu)建　242
參考文獻(xiàn)　258
第7章　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成維生素K2　262
7.1　維生素K2合成概述　263
7.1.1　七烯甲萘醌　263
7.1.2　傳統(tǒng)提高M(jìn)K-7合成的策略　266
7.1.3　菌株改造高效合成MK-7　268
7.2　增強(qiáng)前體供應(yīng)提高M(jìn)K-7的合成　269
7.2.1　增強(qiáng)甲萘醌典型合成途徑對(duì)MK-7合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響　271
7.2.2　增強(qiáng)分支酸合成途徑對(duì)MK-7合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響　273
7.2.3　增強(qiáng)MEP途徑對(duì)MK-7合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響　274
7.2.4　關(guān)鍵基因menA對(duì)MK-7合成的影響　276
7.3　動(dòng)態(tài)調(diào)控MK-7合成途徑及發(fā)酵放大　278
7.3.1　群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控MK-7的合成　279
7.3.2　在5L生物反應(yīng)器中發(fā)酵合成MK-7　281
7.3.3　在15L生物反應(yīng)器中發(fā)酵合成MK-7　282
7.3.4　在3 t生物反應(yīng)器中發(fā)酵合成MK-7　283
7.4　比較轉(zhuǎn)錄組分析限制MK-7合成的因素　284
7.4.1　生物膜的形成對(duì)MK-7合成的影響　285
7.4.2　比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析基因表達(dá)差異　286
7.4.3　在B subtilis168中過表達(dá)差異基因驗(yàn)證其對(duì)MK-7合成的影響　291
7.4.4　在BS20中過表達(dá)差異基因驗(yàn)證其對(duì)MK-7合成的影響　292
7.4.5　電子傳遞鏈對(duì)MK-7合成的影響　294
7.4.6　搖瓶驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與電子轉(zhuǎn)移對(duì)MK-7合成的影響　297
7.4.7　15L發(fā)酵罐驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與電子傳遞對(duì)MK-7合成的影響　297
參考文獻(xiàn)　300
第8章　枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠合成乙酰神經(jīng)氨酸　304
8.1盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建和模塊化優(yōu)化　305
8.1.1　NeuAc合成途徑的構(gòu)建　305
8.1.2　GlcNAc和PEP模塊化途徑工程的設(shè)計(jì)與構(gòu)建　307
8.1.3　GlcNAc和PEP模塊化途徑工程對(duì)NeuAc合成的影響　309
8.1.4　中心代謝途徑改造提高葡萄糖向NeuAc的轉(zhuǎn)化率　310
8.1.5　優(yōu)化ytsJ基因表達(dá)水平提高蘋果酸向NeuAc的轉(zhuǎn)化率　310
8.1.6　小結(jié)　313
8.2　盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑熱力學(xué)瓶頸和限速步驟的解除　314
8.2.1　NeuAc合成途徑熱力學(xué)瓶頸分析　314
8.2.2　通過關(guān)鍵酶自組裝和途徑替換解除NeuAc合成熱力學(xué)瓶頸　315
8.2.3　不同表達(dá)水平NeuAc合成途徑關(guān)鍵酶驗(yàn)證解析限速步驟　318
8.2.4　基于NeuAc響應(yīng)元件的NeuB定向進(jìn)化系統(tǒng)的構(gòu)建　319
8.2.5　通過NeuB定向進(jìn)化和不同來(lái)源高催化活性酶替換緩解NeuAc合成途徑限速步驟的影響　322
8.2.6　小結(jié)　323
8.3　盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑所產(chǎn)生細(xì)胞代謝壓力的解析和解除　324
8.3.1　強(qiáng)化NeuC途徑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和NeuAc合成的影響　324
8.3.2　不同表達(dá)水平NeuAc合成途徑關(guān)鍵酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和NeuAc合成的影響　325
8.3.3　不同強(qiáng)度三條NeuAc合成途徑復(fù)合對(duì)NeuAc合成效率的影響　328
8.3.4　小結(jié)　330
8.4　磷酸烯醇丙酮酸高效供給系統(tǒng)的構(gòu)建和優(yōu)化　331
8.4.1　蘋果酸供給PEP系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化　331
8.4.2　葡萄酸供給PEP系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化　332
8.4.3　葡萄糖酸響應(yīng)元件的構(gòu)建與優(yōu)化　334
8.4.